前言
年1月美国加州大学旧金山分校威尔神经科学研究所在《NatureReviewsNeurology》发表了一篇宏基因组测序在神经系统感染中应用的综述文章，文章介绍了与宏基因测序技术相关的检测过程及生物信息学挑战，以帮助神经学家理解这些挑战对检测效能及结果解读的影响。此外，还提供了建议，以帮助神经科医生和其他内科、感染病科、重症监护室和风湿病专科医生决定是否使用以及何时使用mNGS技术、如何解读阳性或者阴性结果的临床意义。
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送检样本选择
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评估送检样本的质量：脑脊液样本在mNGS检测前已在室温下储存或在4℃下冷藏数天，微生物的核酸（尤其是RNA）可能已降解，导致mNGS可能产生假阴性结果。
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评估送检样本的采样时间：mNGS易受到与传统的病原体特异性PCR相同的影响，如样本中无核酸时，则PCR和mNGS检测不到。因此需要结合病情考虑：
1）慢性感染性脑膜脑炎，一般认为症状超过1个月，所以可能有一个更宽的时间窗口，使得脑脊液中可能含有微生物核酸。
2）急性病毒性脑炎（例如西尼罗河病毒引起的脑炎），病毒可能只在发病的最初几个小时或几天内存在于中枢神经系统。如果在距离患者急性病发作时间较远的时间采集脑脊液，进行mNGS可能无助于识别引发感染的病原。
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了解病人在获得样本之前是否使用过抗菌药物：使用抗生素后会降低病原体的浓度，尽管PCR和mNGS仍可以检测残留的微生物核酸，但对mNGS阴性结果解读仍需谨慎。
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评估感染的部位或病原体情况：脑脊液的优势在于整个蛛网膜下腔都有微生物，脑和/或脑膜组织活检样本进行mNGS检测也很有价值，但成功与否取决于微生物核酸是否存在于特定组织块中。如果患者的感染是局灶的（例如脑脓肿），或者如果可疑的病原体在CSF中丰度较低，或者通过典型的血清学诊断为阳性，如伯氏疏螺旋体（莱姆病）或梅毒螺旋体（梅毒），则应谨慎解释脑脊液mNGS的阴性结果。
02丨测序文库制备
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样本前处理选择：脑脊液由于其典型的低微生物含量，离心后提取核酸可提高对细胞内病原体的检出；来自病毒的游离DNA则更容易从上清液中提取检测到；真菌和分枝杆菌，通过煮沸或者玻璃珠研磨可以提高核酸提取量。
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检测流程选择：RNA流程需将提取的RNA反转录为cDNA，然后将cDNA（DNA流程直接提取DNA）随机片段化，片段两端加上接头和标签，然后在高通量测序平台进行测序。
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测序平台选择：长读长测序（三代测序）有助于得到较长、完整的核酸片段来组装高度冗余的微生物学基因组，测序时间短。但碱基错误率仍然高于短读长测序（二代测序），这降低了其在检测和诊断中的效用。
03丨生物信息学分析
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通用生信分析流程：首先过滤掉低复杂性的人源序列，去除冗余和低质量序列，然后剩余高质量序列与微生物数据库进行比对。
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数据库构建：NCBI数据库（如Genbank）包含所有已知生物基因组序列，增加了识别不常见病原或不同感染病原的可能性，但错误较多，需要与其他数量有限但质量更高的的数据库联合使用，以减少匹配错误。
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生物信息学算法：短序列组装后比对花费时间更长，而使用原始短序列可进行快速搜索；核苷酸比对的相对权重更严格，可以减少虚假比对。
04丨数据解读
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生信分析后，首要任务是确定哪些是疑似致病病原体，哪些是污染菌（如来自皮肤菌群或实验室试剂）。脑脊液虽属于无菌体液，但因脑脊液中的病原体载量通常较低，检测试剂中的微生物容易被放大。
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通过添加已知序列的核酸片段，在不牺牲检测敏感性的同时，可减少测序试剂带来的过度污染；使用“无模板””（即无菌水）和非感染的脑脊液作为阴性对照可以反映实验室中存在的微生物及皮肤菌群。
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测序序列的丰度与脑脊液中病原体的丰度有显著的相关性，但非线性相关，可能会因若干因素而变化（如RNA降解、样品提取效率和PCR扩增偏差等）。
因此mNGS检出的潜在病原体必须结合临床信息，以确定是否具有临床意义，需要神经科专家、感染病专家、实验室医学专家和mNGS专业人士组成，对mNGS结果进行分析和讨论。
05丨深入分析
除了鉴定感染病原外，mNGS数据还能进行多种深入分析，比如系统发育分析，从而帮助确定患者感染的时间和地点；确定是否存在抗菌药物耐药基因；确定医院或其地理区域更广泛的疾病有关。深入分析的结果目前不是临床mNGS报告的一部分，但可与治疗医生讨论并告知，甚至可以协助启动公共卫生响应。
06丨病原富集和宿主去除技术
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当脑脊液样本中病原载量低和/或人源背景高或环境背景污染时，在当前测序能力快速提升和测序价格急剧下降的情况下，增加测序覆盖深度是提高mNGS检测灵敏度可行的解决方案。
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宿主去除，如宏转录组中去除线粒体和核糖体RNA、杂交去除丰富序列（DASH），通过反向富集一定程度提高病原检出率。考虑到宿主基因组分散分布，通过杂交有效去除人源DNA来富集病原序列仍很具挑战性，选择性去除有限数量的基因组并不能显著提高非人序列的检测能力。
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富集技术，如脊椎动物病毒基因组捕获（VirCapSeq-VERT）、杂交富集低丰度序列（FLASH）、标记特异引物富集等，可不同程度的提高病原检出率，但会带来一定偏向性。
参考文献：
RamachandranPrashanthS,WilsonMichaelR,Metagenomicsforneurologicalinfections-expandingourimagination.[J].NatRevNeurol,,undefined:undefined.
本综述在本周分已两部分进行发布，第一期请见：
重磅综述丨宏基因组测序在神经系统感染中的应用（一）
作者：谢俊
编辑：赵晓晶
校审：孙经梦
唯菌论
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