莫煜楠彭倩宜翻译刘志勇校对
摘要
原理：脓毒症引起脑功能障碍和神经系统炎症。目前尚不清楚脓毒症中的神经炎症是由细菌传播到大脑并持续感染引起的，还是仅仅由循环炎症介质导致的一种无菌过程。
目的：确定肠道细菌是否在脓毒症期间转移到大脑，并与神经炎症有关。
方法：采用盲肠结扎穿孔构建小鼠脓毒症模型，并与假手术组和非手术组比较。将死于脓毒症患者的脑组织与死于非感染性疾病的患者进行比较。用16SrRNA基因测序对小鼠和人类大脑标本中的细菌分群进行了分析，将脓毒症组和非脓毒症组进行比较，并与神经炎症标志物SA8水平进行了相关性分析。
结果：腹腔源性脓毒症存活5天后，小鼠大脑中肠相关菌数量增加(p0.01)，14天后未见明显变化。脑相关菌群结构与神经炎症程度相关(p0.)。此外，死于脓毒症的患者大脑中检测到的细菌分类群与死于非感染性疾病的患者大脑中检测到的细菌分类群有显著性差异(p0.)，并与SA8/A9表达相关(p0.05)。
结论：在小鼠脓毒症中，细菌易位与急性神经炎症有关，但细菌易位不会导致慢性颅内感染。死于脓毒症的病人尸检分析证明细菌在脓毒症急性脑功能障碍中发挥作用。
关键词：炎症，微生物群，SA8
介绍
脓毒症是一种危及生命的器官功能障碍综合征，与宿主对感染的反应有关，常常与急性和慢性脑功能障碍有关。死于脓毒症的患者会出现脑凝血障碍、缺血和炎症，在动物模型中，脓毒症会导致持续性的神经系统炎症。虽然与宿主对感染反应相关的多种机制在脓毒症中可引起终末器官损伤，但目前尚不清楚肠道微生物群的全身传播是器官功能障碍发展的重要组成部分，还是器官功能障碍仅仅是由于宿主反应失调(但主要是无菌的)所致。我们之前已经发现脓毒症和ARDS与肺部肠道相关细菌的富集有关。肠内细菌的传播并不是腹腔源性脓毒症模型所特有的；肺炎假单胞菌感染也可导致肠道细菌的传播。因此，有可能是活的细菌，而不仅仅是循环中的细胞因子，在远隔初始感染部位的器官中刺激炎症的发生。
脂多糖(LPS)和其他纯化细菌产物的全身给药常被用作脓毒症和先天免疫激活的模型。LPS下游信号通路的直接和压倒性的激动作用确实会产生显著的神经炎症，包括大脑的主要先天免疫细胞小胶质细胞的形态学变化和细胞因子的表达。然而，越来越多的证据表明，即使在无菌性炎症中，暴露于炎症介质的剂量和时间也可能导致先天免疫的启动或抑制。随着时间的推移，所有细菌和多种细菌抗原在微循环或脑实质内的存在，可能会引发一种明显不同的免疫反应，而不是单一地大量暴露于特定的病原体相关分子。
我们假设脓毒症患者和脓毒症存活者的神经炎症不仅是由无菌炎症介质引起的，而是与大脑中细菌的存在有关。我们进一步假设，细菌易位是短暂的，在脓毒症动物模型中观察到的长时间的神经炎症不仅仅与未解决的感染有关。在这里，我们使用了一种模拟自然状态的脓毒症小鼠模型来证明，存活的肠道相关细菌会传播到大脑，甚至在感染后的几天内也能在脓毒症存活小鼠中发现。我们支持细菌传播作为大脑对感染反应的驱动因素的合理性，因为有证据表明，在死于脓毒症的患者的大脑中，细菌传播与神经炎症有关，即使是没有临床显著菌血症的患者。这些研究的一部分结果以前曾以摘要形式报告过。
材料与方法
小鼠：本实验中使用的野生型小鼠为来自Jackson实验室的雄性C57BL/6小鼠，年龄8-10周龄。CX3CR1-GFP::CCR2-RFP报告基因小鼠在8-12周龄时使用。
脓毒症模型：盲肠结扎和穿孔如前所述，使用19号针单次穿刺。手术时皮下注射亚胺培南/西拉他汀(默克公司，0.5mg/小鼠)和生理盐水(1mL)。假手术动物不结扎和穿刺盲肠，同样给予抗生素和生理盐水。
菌落形成单位试验：将脑组织匀浆、血液或腹腔灌洗液的混合液以十倍稀释的方式涂于LB培养基上，37℃有氧培养。菌落生长24小时后计数，用菌落PCR法鉴定。
病人脑组织的鉴定和分离：人类脑组织标本来自密歇根大学脑库。如果患者死时诊断为脓毒症或有感染和器官损伤的证据，则被认定为脓毒症。如果患者在没有感染证据的情况下死亡，并有可确定的死亡原因，则被确定为死于非传染性原因。这些病例也用于另一份研究脓毒症中SA8表达模式的研究。
细菌DNA分离和16SDNA测序：从小鼠或人类脑组织中提取基因组DNA。利用已发表的引物和PatrickD.Schloss实验室开发的双索引测序策略，如前所述，扩增了16SrRNA基因的V4区域。
OTU的生存能力测定：利用NCBIBLAST鉴定符合拟杆菌门OTU的序列(OTU,%覆盖率和一致性)，并在小鼠粪便和结肠黏膜中进行了鉴定。为了确定OTU是一种活菌还是来自被杀死生物体的残留核酸，我们在厌氧条件下培养了脑匀浆。使用OTU特异性引物进行PCR，以验证在这些混合培养物中是否存在繁殖细菌。
统计分析：如前所述，使用mothurv.1.27.0软件处理和分析序列数据。如文中所述，对平均值或中位数进行了比较。
结果
脓毒症诱导细菌向大脑短暂传播：为了研究脓毒症是否会导致细菌向大脑传播，我们使用了盲肠结扎穿孔(CLP)，这是一种典型的多微生物脓毒症和存活的小鼠模型。我们之前的研究表明，CLP可导致脓毒症后至少2周脑内白细胞浸润和炎性细胞因子的产生，之后白细胞浸润逐渐恢复，但细胞因子在接下来的50天内持续表达。因此，我们研究了通过微生物培养和16S核糖体RNA编码基因测序从大脑和血液中分离出的微生物群，主要目的是确定脓毒症后持续的神经炎症是否仅仅是低级别慢性细菌性脑炎的结果。
考虑到CLP有可能同时传播需氧和厌氧细菌，我们通过16SrRNA基因测序对大脑中存在的细菌分类群进行了无偏差分析。脓毒症诱导一天后，在脓毒症小鼠的大脑中检测到的细菌序列与假手术和非手术对照组不同(图1a;PERMANOVA,p=0.)。非手术对照组未接受抗生素治疗。治疗组之间的差异反映了一系列广泛的细菌分类群，这些细菌分类群与非手术对照中检测到的背景信号不同，并反映了小鼠肠道微生物群的预期组成，但没有一个分类群具有明显的优势(图1b)。假手术后24小时，或非手术对照组(每组n=4，未显示)的血液需氧培养中没有细菌生长。
为了确定CLP是否会导致大脑长时间接触细菌，我们检测了脓毒症存活小鼠的大脑微生物群。干预5天后，在脓毒症存活小鼠的大脑中检测到的细菌序列与假手术、抗生素治疗和未治疗组不同(p=0.，图2a)。在CLP发生后14天和50天，各组间的CLP细菌序列差异不明显(p=0.和0.，图E1c)。与急性疾病动物相比，脓毒症后5天细菌群落结构的差异主要是由单个拟杆菌分类群(bacteroidals-classificationgroup,OTU)、OTU和肠球菌分类群(EnterococcusclassificationOTU，图2b)引起的。在脓毒症后5天，这种拟杆菌的相对丰度在脓毒症存活动物中显著增加(p≤0.01)，但在脓毒症后14天恢复到背景水平(图1c)。
为了确定16SrRNA基因分析检测到的序列是否代表活菌或来自生物死亡的残留核酸，我们取了脓毒症存活小鼠的大脑匀浆进行培养。在CLP后5天，从脓毒症存活小鼠的大脑需氧培养中分离出粪肠球菌(图3a)，但没有从血液中培养出来(图E1a)。粪肠球菌在CLP后14天或50天没有从大脑中培养到，也没有从假手术动物或未经抗生素治疗的对照动物中培养到(图1a、E1b)。为了检验OTU的生存能力，我们在CLP术后5天，从厌氧条件下用非手术对照组小鼠的大脑匀浆进行培养。OTU在脓毒症存活小鼠或对照组小鼠的原脑裂解物PCR种均检测不到，但在脑组织的厌氧培养中很容易扩增出来，这表明活菌在体外生长，因此存在于脓毒症存活小鼠的大脑中(图3b)。
在脓毒症患者和实验脓毒症模型种大脑神经炎症微生物群改变相关：在我们的脓毒症实验模型中，大脑存在明显的细菌暴露，我们质疑脓毒症患者的脑微生物群落与非脓毒症死亡患者的脑微生物群落是否存在差异。我们回顾了密歇根大学脑库中死于脓毒症(表E1)或死于明确的非传染性病因(表E2)的研究对象的记录。
我们发现脓毒症患者的大脑中检测到的微生物群存在明显的变异，包括与上呼吸道和下消化道相关的大量菌群(图4a)。脓毒症和非脓毒症脑标本的区别，主要是由于嗜血杆菌、奈瑟菌和莫拉克菌的相对丰度不同，个别脓毒症患者的脑标本以肠杆菌科和拟杆菌科等肠道相关类群为主。阴性测序对照标本中均未富集脓毒症相关菌群。总的来说，死于脓毒症的患者与非脓毒症对照组相比，16SrRNA基因测序在大脑皮层组织中鉴定的细菌分类群有明显差异(PERMANOVA,p=0.0)。
病例报告表明，死于脓毒症的患者表现出与神经炎症相关的脑细胞因子表达增加。因此，我们用多元分析(Luminex,RDSystems)研究了IL-1α,IL-1β,IL-1RA,IL-4,IL-6,IL-8,CCL2,CCL3,CCL4和TNFα在脑裂解物中的表达。经多次比较调整后，这些炎症介质中的任何一种在死于脓毒症和非感染性原因的患者大脑中的表达均无显著差异(图E2)。基于先前的动物研究，我们假设内源性炎症介质SA8/A9在脓毒症患者中的表达会升高。
以SA8/A9蛋白浓度作为协变量，分析从人脑标本中鉴定的16S序列，我们发现SA8/A9蛋白浓度测定的神经炎症与细菌类群的群落结构显著相关(PERMANOVA,p=0.，图4b)，表明SA8/A9浓度相近的人脑标本经16SrRNA基因测序，细菌群落结构相似。
SA8的表达甚至在小鼠实验性脓毒症早期存活者中也与脑微生物群有关。我们测量了同样用于研究微生物群变化的动物大脑皮层组织中SA8的表达。与对照组相比，脓毒症5天后，SA8基因在大脑皮层的表达显著增加(p≤0.，图5a)。SA8的表达与小鼠脑内细菌类群的群落结构密切相关，受上述拟杆菌目OTU相对丰度差异的影响(p≤0.，图5b)。脓毒症存活小鼠在CLP后5天也表现出微神经胶质反应改变的证据。与假手术动物相比，海马和运动皮质的小胶质细胞标记物Iba1的免疫反应性均增加(曼-惠特尼u检验，p=0.，图5c,d)。用表达CX3CR1的GFP报告基因鉴定分离的小胶质细胞和组织巨噬细胞(图5e)，表明在用LPS离体刺激后引发TNFα的产生（图5f）。脓毒症存活小鼠的神经炎症，我们之前已经发现可以持续至CLP后2个月，可能是由慢性腹腔感染和全身炎症引起的。然而，腹膜感染(图E3a)和中性粒细胞渗出(图E3b)在CLP后第一周均有明显改善。
讨论
我们研究的主要发现是，脓毒症会导致细菌向大脑传播数天，最终在发病后数周内消退。不同细菌分类群的存在与SA8表达有关，SA8表达是神经炎症的一种标志物，在死于脓毒症的动物和人类中都存在。我们的研究结果表明，不仅是无菌循环炎症介质，存活的细菌在脓毒症后的脑功能障碍的发病机制中也起着重要作用。
在脓毒症期间，大脑很容易受到许多损伤。脑梗塞、出血、微脓肿和脓肿已在死于脓毒症的病人的尸检研究中得到证实。我们可以假设，任何细菌感染患者都有在多个器官系统中发生微脓肿的风险，而这个过程是脓毒症器官功能障碍的基础。一些常见的细菌，如金黄色葡萄球菌，在暴发性感染的情况下会形成播散性脓肿，包括在大脑中。同样，在肺炎模型中，链球菌直接传播到心肌也会导致心功能障碍。尸检中局灶性感染的发生在脓毒症中很常见，但播散性微脓肿很少见，在几个病例中几乎没有脑炎或脑脓肿。同样，在目前的研究中，只有一名患者在尸检中有明显的颅内感染的大体或组织病理学证据(表E1)。
如果在脓毒症的许多病例中没有细菌传播的组织学证据，那么脓毒症中的脑功能障碍是否与细菌的存在完全相关？只有大约三分之一的脓毒症患者检出菌血症，这导致了一种假设，即LPS等无菌介质或宿主对感染反应失调是器官功能障碍的主要驱动因素。然而，关于无菌内毒素血症作为人类脓毒症模型的准确性存在重大争议。我们的数据表明，在脓毒症期间，即使没有明显的感染，存活的细菌也会转移到大脑。在小鼠脓毒症幸存者中，在没有菌血症的情况下在大脑中检测到可培养的需氧菌，这表明易位要么发生得非常短暂，要么血液中的细菌数量很低，而一旦在大脑微血管系统中捕获细菌，细菌就更容易被检测到。然而，对大脑中未培养的厌氧菌鉴定表明，许多播散的细菌可能只是无法用培养依赖的方法检测到。
由于病原体相关分子的免疫反应随暴露时间、多样性和强度的不同而变化很大，因此了解即使是少量细菌的传播对于预测和了解该综合征器官功能障碍的发病机制至关重要。虽然我们发现大脑微生物群的变化与神经炎症有关，但并不是说，在危重疾病中，接触微生物病原体是导致急性或慢性脑功能障碍的唯一途径。谵妄与多种危重疾病有关，呼吸衰竭和休克的幸存者患有慢性脑功能障碍。小胶质细胞在谵妄患者的大脑中被激活，即使在没有脓毒症的情况下也是如此。包括缺血、神经递质失衡和血管功能障碍在内的多种机制可能导致危重症的脑功能障碍。然而，有证据表明，阿尔茨海默病的病理特征淀粉样纤维在宿主对细菌的防御中发挥了作用，这表明免疫机制是随着大脑直接暴露于细菌而进化的。即使在主要是非传染性的危重疾病如中风中，肠道通透性的增加也可能增加细菌易位的风险，而调节肠道微生物群可能是治疗和减少并发症的靶点。
我们在小鼠实验中鉴定的拟杆菌OTU与候选家族Homeothermaceae同源性最强。虽然这些细菌的潜在致病性尚不清楚，但它们确实携带有抗氧化应激和菌毛组装的基因，类似于卟啉单胞菌属的病原体。最近首次培养了该家族的一名成员，这为培养其他同源异种成员并直接研究其致病性开辟了可能。
虽然我们的结果支持了细菌易位参与神经炎症起始的假设，但在这个模型中我们没有发现慢性细菌感染大脑的证据。在某些重症CLP中，建立了慢性腹腔内感染模型，但在我们的模型中，腹腔感染和炎症得到了控制。脓毒症后2周，我们没有在大脑中发现细菌的证据，因此脓毒症后的持续性神经炎症可能是由于宿主免疫反应的重新编程，而不是由于持续性或慢性感染。
我们的动物和人类研究都只证明了大脑微生物暴露和神经炎症之间的联系，而不是因果关系。在这里的人类和动物研究中观察到的微生物群和神经炎症的差异有可能是脓毒症全身炎症的无关结果。使用CLP作为脓毒症模型的一个限制是，肠道是感染的主要来源。抗生素治疗清除肠道微生物群将改变CLP基本病情的严重程度，因此不能阐明细菌传播在神经炎症中的独立作用。我们正在开发其他脓毒症生存模型，以解决肠道微生物对脓毒症后长期器官功能障碍的独立影响。此外，尽管使用动物模型可以让我们研究随着时间的推移大脑中细菌分类群的变化，但对脓毒症患者大脑中细菌的研究必然受到急性疾病致死的限制，这就带来了一些混淆的来源。本研究中的少数患者没有对这些因素进行调整，但他们为未来研究的设计提供了有用的指导。
在我们的研究中，除了脑微生物群，脓毒症组和非脓毒症组之间还有一些重要因素的不同。脓毒症组的患者比非脓毒症死亡的患者接受了更多的抗生素。虽然我们假定脑实质在健康状态下是无菌的，但病人来源的样本在死后的时间间隔内易发生移位和细菌的生长。因此，在生活中使用抗生素可以改变我们在研究中观察到的16S序列。肠道微生物群通过循环细菌代谢物参与维持血脑屏障、脑白细胞转运和神经形成。因此，即使在没有脓毒症的情况下，抗生素引起的生物失调也可能导致脑功能障碍。
神经退行性疾病在脓毒症组也比非脓毒症对照组更为普遍。并非所有大脑SA8/A9水平升高的患者都有阿尔茨海默病的潜在诊断。阿尔茨海默病与SA8和SA9水平升高有关，尽管这些蛋白的纤维形式是否会对这里使用的异二聚体特异性检测产生反应还不清楚。SA8/A9作为一种损伤相关的分子模式，不仅在脓毒症或感染中，缺血和缺氧也会使SA8/A9升高。与没有脓毒症的患者相比，脓毒症组的患者确实有较长时间的无代偿过程，而且之前已经在脓毒症和谵妄患者的死后脑标本中发现了缺氧的迹象。我们试图在这些组织中寻找替代的脑炎症蛋白标记物，但没有成功。在这种情况下，SA8/A9作为炎症标志物的作用可能是由于其初始表达量高，或该标志物对样品存储条件的稳定性。
尽管存在这些混淆因素，我们的人类和小鼠数据都阐明了使用16S测序分析大脑微生物群的希望和误区。虽然之前的一项研究使用与培养无关的技术对人类大脑微生物群进行了研究，其中包括感染和急性脑部病变的患者。在给予抗生素治疗小鼠的对照条件下，对灌注脑组织中16SrRNA基因序列进行测序，可产生与多种细菌(包括肠道病原体)相关的信号，而这些信号在仅使用试剂的对照中不存在。有几个因素可以解释这种差异。首先，在没有活生物体的情况下，微生物DNA可能存在于循环或循环白细胞内。然而，我们发现在本研究中检测到的最丰富的拟杆菌16SDNA来自一个活的生物体。其次，当生物样品中含有丰富的核酸时，PCR扩增和基因测序的错误可能比试剂对照更频繁。存活的需氧菌不太可能一直存在于健康的小鼠大脑中，其数量低于基于培养方法检测的限度。
我们已经证明，脓毒症会导致脑细菌分类群的改变，这在脓毒症存活的小鼠模型和死于脓毒症的患者中都与神经炎症有关，提示细菌向大脑的直接易位在脓毒症的脑功能障碍中起着重要作用。目前，脓毒症的抗菌治疗往往针对假定的感染源，而且往往不包括对肠道相关厌氧菌的经验性治疗。临床试验表明，选择性清除肠道细菌可以减少器官功能障碍，改善脓毒症的预后，尽管这种做法尚未在世界范围内被采用。本研究和其他研究表明，应重新
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