近期国际权威期刊《NatureReviewsNeurology》（IF=27）在线发表“Metagenomicsforneurologicalinfections—expandingourimagination”。该研究由美国加利福尼亚大学威尔神经科学研究所与美国加州大学旧金山分校神经学系合作完成。文章报道了mNGS在脑炎、脑膜炎和脊髓炎等神经炎症综合征患者诊断中的技术优势和缺陷，并预测mNGS如何与当前的诊断检测相结合。文章介绍了与宏基因测序技术相关的检测过程及生物信息学挑战，以帮助神经学家理解这些挑战对检测效能及结果解读的影响。此外，还提供了建议以帮助神经科医生和其他内科、感染病科、重症监护室和风湿病专科医生决定是否使用以及何时使用mNGS技术、如何解读阳性或者阴性结果的临床意义。
概述
研究表明，约50%的脑炎患者没有得到明确的病因诊断，临床迫切需要改进诊断检测技术，为神经系统感染提供进一步技术支持。mNGS技术可以无偏倚的同时检测样本中的全部病原微生物，可以鉴定出最初诊断未识别的部分病原体，如临床表征不典型的病原体，新发病原体或罕见病原体。
关键点速递
由于多种可能的感染性和自身免疫性原因，脑膜脑炎的诊断仍然具有挑战性。
脑膜脑炎发病率和死亡率高，需要及时诊断和治疗。
病原宏基因组测序mNGS是一种经临床验证的神经系统感染检测技术，可帮助临床医生及时诊断。
mNGS可提高对临床医生或标准检测方法遗漏的病原体的检测能力。
当需要间接检测方法来进行诊断（例如血清学）、感染分为不同的区域以及针对某些低丰度病原体时，mNGS表现不佳。
在解释mNGS结果时，需要了解并结合病例的临床背景综合判断。
宏基因组测序注意事项
一
送检样本的选择
评估送检样本的质量
脑脊液样本如果已在室温下储存或在4℃冷藏数天，微生物核酸（尤其是RNA）可能已降解，可能导致mNGS假阴性结果。
评估送检样本的采样时间
如果样本中无核酸，PCR和mNGS都检测不到。因此需要结合病情：例如慢性感染性脑膜炎患者，一般症状超过1个月，因此有更宽的时间窗口，使脑脊液中可能含有微生物核酸。而急性病毒性脑膜炎患者，病毒只在发病最初几小时或几天存在于中枢神经系统，因此距离这类患者发作较远的时间采集脑脊液样本可能无助于mNGS检测。
是否在送检样本前使用过抗生素
抗生素使用会降低病原体浓度，尽管PCR和mNGS可以检出残留的微生物核酸，但仍需谨慎解读阴性结果。
感染的部位
脑和/或脑膜组织活检样本对mNGS也很有价值。然而这种方法的成功与否取决于微生物是否存在于提取核酸的特定组织中，而脑脊液的优势在于它是整个蛛网膜下腔(如果不是整个大脑的话)微生物的来源。如果患者的感染是局灶的（例如脑脓肿），或者如果可疑的病原体在CSF中丰度较低，或者通过典型的血清学诊断为阳性，如伯氏疏螺旋体（莱姆病）或梅毒螺旋体（梅毒），则应谨慎解释脑脊液mNGS的阴性结果。
二
测序文库的制备
样本前处理选择
脑脊液由于微生物含量非常低，在获得样本后，通过离心从1ml的脑脊液样本中提取核酸（目前临床验证的分析建议至少μl）可以显著提高对细胞内病原体的检出。比如上清液更容易提取检测到病毒游离的DNA，通过煮沸或玻璃珠研磨可提高真菌和分枝杆菌的核酸提取量。
检测流程选择
RNA需要先反转成cDNA（DNA直接提取即可），然后cDNA经过随机片段化，两端加上接头和标签，在高通量测序平台进行测序。
测序平台选择
长读长测序（三代测序，如Nanopore、Pacific）有助于获得较长、完整的核酸片段，来组装高度冗余的微生物学基因组，测序时间短。但三代测序碱基错误率仍然高于短读长测序（二代测序，如Illumina），这降低了其在感染检测和诊断中的应用价值。
三
生物信息学分析
高通量测序技术会产生非常大的数据集，每个样本生成5-20Mreads数。在开始分析前，需要先过滤掉数据中人源的、低复杂序列、冗余序列和低质量序列。在获得过滤后的非人源、高复杂度、非冗余和高质量序列后，我们就需要做出生物信息学决策。首先，要决定用哪一个数据库做序列比对；其次，是否先将短序列信息组装成更长的序列以进行更特定的生物体比对，或者是否使用原始的短序列信息进行初始搜索；最后，需要对核苷酸比对的相对权重做出决定。
四
数据解读
生信分析后，最主要的任务是确定哪些是疑似致病病原体，哪些是mNGS过程中不可避免的污染（如皮肤定植，或者试剂工程菌污染）。尽管脑脊液是一种无菌体液，但由于脑脊液中的病原体载量通常较低，检测试剂中微生物容易被放大。
降低污染影响的方法有两种：
a)添加已知序列的核酸片段，在不牺牲敏感性的前提下，减少测序试剂带来的过度污染；
b)使用“无模板”（即无菌水）和非感染的脑脊液作为阴性对照，以反映实验室中存在的微生物和皮肤菌群。
测序序列丰度与脑脊液中病原体的丰度有显著的相关性，但不是线性的，可能会受若干因素影响，如RNA降解、样品提取技术和PCR扩增偏差等。因此mNGS的结果需要结合临床信息进行分析和讨论。
五
二次分析
除了鉴定感染病原外，mNGS数据还能进行多种深入分析，比如确定是否存在抗菌药物耐药基因；进行系统发育分析，从而帮助确定患者感染的时间和地点，以及确定特定医院或其他区域的疾病爆发有关。
六
病原富集和宿主去除技术
随着测序能力的快速提升和测序价格的迅速下降，在脑脊液样本中病原载量低和/或人源背景高或环境背景污染的情况下，通过增加测序深度以提高mNGS检测灵敏度变得更加可行。
1)宏转录组测序（RNA）：去除线粒体和核糖体RNA，可有效提高病原体检出率。
2)宏基因组测序（DNA）：由于DNA在人类基因组分布更均匀，通过杂交有效去除人源DNA来富集病原序列仍很具挑战性，靶向去除有限数量的基因组并不能显著提高非人序列的检测能力。
目前的富集技术有以下几种方法：
a)如脊椎动物病毒基因组捕获（VirCapSeq-VERT）
b)杂交富集低丰度序列（FLASH）
c)标记特异引物富集
宏基因组测序的利弊
优点
一次检测可同时覆盖真菌、细菌、DNA病毒、RNA病毒和寄生虫
能够识别新发病原体
能够识别临床表征不典型的病原体或临床被忽视的常见病原体
临床可行的验证方法越来越多
缺点
价格昂贵
依赖样本中是否存在微生物核酸，因此对局部感染或短期感染敏感度不高
对低丰度病原感染或高人源背景的感染敏感度不高
环境污染可能导致假阳性，需要考虑临床实际情况
总结
本综述讨论了mNGS技术能够改善神经系统感染方面的诊断，并且展望了其发展前景。mNGS的无偏倚特性使得其能够在临床信息不完整的情况下，帮助临床医生有效评估一个复杂的病例。然而非常重要的是，需要全面了解mNGS技术的优缺点，避免陷入对技术的盲目依赖。即使是最先进方法的检测结果，医生也必须在充分了解病人的临床实际情况后，根据临床实际和临床文献去加以解读。
参考文献：
[1]Ramachandran,P.S.Wilson,M.R.Metagenomicsforneurologicalinfections-expandingourimagination.NatRevNeurol,doi:10./s---y(2).
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